一、PCR的退火温度怎么设定?
PCR中退火的那步是引物与模板结合,一般来说,退火温度比Tm值要低上5度左右。另外,也可以根据你设计引物的软件比如primer5.0或Olige 6 推荐的温度。但这些都不是绝对的。
你要是在他的推荐温度下没有目的条带,你可以试试做一个温度梯度,摸索一下退火温度。
二、pcr仪器各个温度的含义?
PCR仪的三种控温模式
在进行PCR仪中控温模式设定时,一般有三个选项:Block、Tube及Probe。下面就这三种模式种简单的介绍:
PCR仪的温度传感器一般是在模块下面的,也就是说仪器实际能够控制的是模块的温度,Block模式指的就是仪器以控制Block的温度为目的,也就是说你输入95度5分钟,则模块的温度达到95度后开始计时,5分钟后完成。这是zui基本的控温模式。
但是,实际上我们输入95度5分钟是希望PCR管内的温度达到95后开始计时5分钟。PCR仪器开发人员可以先将模块温度控制到97度(比如而已,如果不超过95度,管内温度可以很长时间才能达到95度或根本达不到),过几秒钟后,等到管内温度达到95度,再将模块温度降到95度。这样做既达到了管内温度到95度,且速度较快。但过冲的温度量与时间及PCR管的导热系数、PCR反应液的体积都有关系。这就是各个PCR仪厂家的核心技术了。这种控温方式就称为Tube模式。
如果直接将一个温度传感器加入PCR管中,直接测量PCR管内的温度不是也可以吗?这就是Probe模式,也就是在一个不进行PCR反应的管内放入一个温度探头,仪器根据温度探头测到的温度来控制PCR管内的温度。但传感器的数据检测、分析及反馈是需要时间的,这种控制模式不一定比Tube模式好,而且如果反应体积发生变化时,就比较麻烦了。
因此,如今的PCR仪就都是Block和Tube两种模式了。如果是正常的PCR反应,一般选Tube模式。如果是长时间保温且对温度过冲要求很高,则可以考虑用Block模式。
三、pcr设定温度怎么来的?
pcr温度设定主要是4个依据:
1. DNA变性温度,这个一般而言94~98℃都能保证DNA完全变性,双链分开;
2.DNA复性,这个主要是指引物与模板DNA的复性,通过碱基配对形成双链DNA,因此,复性温度因引物不同而有差别;
3.DNA聚合酶活性,这个来源不同,不同突变,略有差异,一般65~72℃。
4.DNA 保存温度,一般情况下DNA在4~15℃可以稳定保存一定时间。因此,pcr结束后保持在这个温度均可。
四、如何设定梯度PCR的退火温度?
回答如下:设定梯度PCR的退火温度需要考虑以下几个因素:
1.引物的Tm值:引物的Tm值是引物特异性的反映,它是引物在PCR反应中结合到模板DNA上的温度。在设定梯度PCR的退火温度时,需要根据引物的Tm值来确定。
2.模板DNA的GC含量:模板DNA的GC含量也会影响PCR反应的退火温度。GC含量高的DNA需要更高的温度来使引物与DNA结合,因此需要设定较高的退火温度。
3.特定目的:设定梯度PCR的退火温度也要考虑到特定的PCR目的。例如,如果需要扩增特定长度的DNA片段,需要根据引物的长度和目标DNA的大小来确定退火温度。
一般来说,可以先进行一次试验,设定一个范围内的温度梯度,然后根据PCR扩增的效果和产物的质量来调整退火温度,直到得到理想的PCR产物。
五、pcr仪器 全名?
pcr仪是光度计,
分光光度计,又称光谱仪(spectrometer),是将成分复杂的光,分解为光谱线的科学仪器。测量范围一般包括波长范围为380~780 nm的可见光区和波长范围为200~380 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。
六、冰晶带设定温度范围?
大部分食品中心温度从-1℃降至-5℃时,近80%的水分可冻结成冰。这个温度区间称为最大冰晶体生成带。 定义和品质如下:
1.大部分食品中心温度从-1℃降至-5℃时,近80%的水分可冻结成冰。这个温度区间称为最大冰晶体生成带。
2.最大冰晶体生成带是保证冻结食品质量的最重要的温度区,冰晶的生成方式对食品的品质起着较大的影响。
3.冻结时通过最大冰晶体生成带的时间短,品质好。
4.耐低温的微生物在最大冰晶体生成带温度范围内仍可生长繁殖。
5.有不少食品的冰点低于-1℃,最大冰晶生成带不同。
七、pcr的延伸温度可选择哪个范围?
1. PCR的延伸温度选择范围比较宽,主要取决于扩增目标序列的长度和目标序列所在的物种类型等因素。2. 在PCR扩增过程中,通常需要进行变温反应,即在不同的温度下进行不同的反应,以达到特定的扩增条件。其中延伸温度就是其中一个重要的环节,通常在60度到75度之间选择。较短的目标序列,延伸温度通常可以在65-72℃之间;而较长的目标序列,则需要较低的延伸温度,一般在60-68℃之间。3. 此外,不同的PCR扩增方法和引物组合等因素也会对延伸温度选择产生影响,因此在进行PCR扩增之前需要充分考虑实验设计和目标序列特点等方面的因素。
八、pcr循环条件的设定?
PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称,是一种常用的分子生物学技术。PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物,有时甚至没有目的产物;而在另一个极端,又可能没有扩增到任何产物。PCR反应条件包括:温度、时间和循环次数。
1、温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值-(5~10℃)
在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:
70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时, DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
2、循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
九、pcr三个关键温度设定的依据是什么?
pcr三个关键温度设定的依据是,第一个一般在94-95度左右,叫做变性,就是通过加热打开双链。
第二个温度点叫做退火,根据引物的tm算出,一般比tm低5度,有利于引物的结合。
第三个温度叫做延伸,一般采用72度。是引物结合后dna聚合酶按照模板合成新的链。一分钟一千个碱基对。
十、冰箱温度设定后波动范围是多少?
冰箱温度设定后波动范围一般控制在3~5℃范围内是比较合适的。对冰箱来说,温度上限和下限的温差带范围过大,虽然可以降低冰箱压缩机的启停频次,但会导致冰箱内实际温度波动幅度过大,从而令所储存的食物变质速度加快。
如果温度上限和下限温差带范围过小,冰箱压缩机启停频次就会升高,冰箱总体耗电量变大。