一、pcr变性温度为什么升高?
热变性dna一般经缓慢冷却后即可复性,简单来说,复性不就是两条互补的单链变成双链吗,所以根据这个特性,完全可以在dna聚合酶的作用下把已经和引物结合在一起的模板链复制出来.所以,pcr必然有有一个温度变化的过程.一般来说dna在高温中容易变性,这就决定了使用的聚合酶必须是耐高温的.
二、PCR哪一步变性温度?
PCR分三步:第一步是变性,温度为95度,第二步复性,温度为55度第三步子链延伸,温度为72度。
三、pcr仪器各个温度的含义?
PCR仪的三种控温模式
在进行PCR仪中控温模式设定时,一般有三个选项:Block、Tube及Probe。下面就这三种模式种简单的介绍:
PCR仪的温度传感器一般是在模块下面的,也就是说仪器实际能够控制的是模块的温度,Block模式指的就是仪器以控制Block的温度为目的,也就是说你输入95度5分钟,则模块的温度达到95度后开始计时,5分钟后完成。这是zui基本的控温模式。
但是,实际上我们输入95度5分钟是希望PCR管内的温度达到95后开始计时5分钟。PCR仪器开发人员可以先将模块温度控制到97度(比如而已,如果不超过95度,管内温度可以很长时间才能达到95度或根本达不到),过几秒钟后,等到管内温度达到95度,再将模块温度降到95度。这样做既达到了管内温度到95度,且速度较快。但过冲的温度量与时间及PCR管的导热系数、PCR反应液的体积都有关系。这就是各个PCR仪厂家的核心技术了。这种控温方式就称为Tube模式。
如果直接将一个温度传感器加入PCR管中,直接测量PCR管内的温度不是也可以吗?这就是Probe模式,也就是在一个不进行PCR反应的管内放入一个温度探头,仪器根据温度探头测到的温度来控制PCR管内的温度。但传感器的数据检测、分析及反馈是需要时间的,这种控制模式不一定比Tube模式好,而且如果反应体积发生变化时,就比较麻烦了。
因此,如今的PCR仪就都是Block和Tube两种模式了。如果是正常的PCR反应,一般选Tube模式。如果是长时间保温且对温度过冲要求很高,则可以考虑用Block模式。
四、pcr变性退火延伸温度与什么有关?
PCR的延伸温度是由引物来决定的,引物的长短、GC的含量都会影响到退火温度
五、pcr变性和复性的温度与什么有关?
模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度。达不到变性温度就不会产生单链DNA模板, PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全。 DNA双链会很快复性。
退火温度与时间。退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强、但过高则引物不能与模板牢固结合。 DNA扩增效率下降,温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配。
循环次数。可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素、设定20-40个循环。
六、pcr温度梯度设置?
温度梯度pcr一般主要是指退火温度梯度。如果PCR仪支持的话,一次可以做好几个温度梯度,象AIB的可以做六个,而有些公司的是模仿梯度,比如一边高一边低,这样梯度温度可能误差大一点。如果仪器不支持,可能就麻烦了,想做六个温度就得做六次PCR了。每一次设成不同的温度。
七、pcr仪设置温度原理?
在pcr反应过程中,要使用三个不同的温度变化,有变性,退火,扩增三个不同的反应阶段,而这三个反应需要的最适温度不同。具体设置如下:
1、变性反应温度的设置
当温度控制在90 °C以上时DNA会发生变性,双链DNA解链成单链。
2、退火反应温度的设置
当温度下降到50 °C的时候,DNA复性,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
3、扩增反应温度的设置
当温度上升到72 °C左右时延伸,DNA 聚合酶在此时有最大活性,能够催化4 种脱氧核苷酸合成新的DNA链。
八、pcr仪怎么设置温度降落?
一般退火温度为从Tm+5度降落至Tm-10度,每度2个cycle,最后在tm-10度上增加5-10个cycle.例:Tm为58度,则从63度降落到48度,每度2个cycles,最后在48度加5-10个cycles。如果效果不好,可以再微调。
九、pcr仪怎样设置固定温度?
您可以通过操作PCR仪的控制面板来设置固定温度。首先,打开PCR仪并选择温度控制模式。
然后,输入您想要设置的温度值,通常以摄氏度为单位。
接下来,确认设置并启动PCR仪以使其达到您所设定的温度。在达到目标温度后,PCR仪会自动维持该温度直至您进行其他操作或程序结束。
另外,一些PCR仪还可提供温度均衡功能,可以在设定的固定温度附近进行微小波动。务必在使用PCR仪前仔细阅读使用手册,以确保正确设置固定温度并确保实验顺利进行。
十、pcr仪盖子的温度如何设置?
现在pcr仪一般都是热盖pcr仪。热盖的作用是无需加石蜡即可启动pcr反应,其原理是通过加热热盖使pcr tube的盖子达到恒定高温,从而防止pcr过程中反复加热和降温导致tube中的水蒸气冷凝,而导致反应体系中的的水分挥发蒸干,破坏反应体系,影响扩增结果。同时,避免了加入石蜡对pcr后期纯化处理的麻烦。
根据热盖的作用,不难看出热盖的温度略高于水的沸点即可,常规温度设置为105~110度。